Papel 3D

Oct 18, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 13657 (2022) Citar este artículo

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La adulteración de la leche es un problema común en los países en desarrollo y puede provocar enfermedades mortales en los seres humanos. A pesar de varios estudios para identificar diferentes adulterantes en muestras de leche, los efectos de múltiples adulterantes siguen sin explorarse. En este trabajo, se diseña y fabrica un dispositivo de microfluidos tridimensional (3D) basado en papel para detectar simultáneamente múltiples adulterantes químicos en la leche. Este dispositivo comprende una cubierta superior, una cubierta inferior y una capa intermedia compuesta por una zona de transporte y de detección. Al realizar cortes en el soporte de la capa intermedia, la trayectoria del flujo del dispositivo se caracteriza por una velocidad óptima y uniforme. Por primera vez, se detectan siete adulterantes (urea, detergentes, jabón, almidón, peróxido de hidrógeno, hidrogenocarbonato de sodio y sal) en la muestra de leche simultáneamente con una evaluación de especificidad y un análisis detallado de interferencia de color. Sólo se requieren de 1 a 2 ml de volumen de muestra para detectar 7 adulterantes a la vez. Hemos utilizado sólo 10 \(\upmu\)L del volumen del reactivo para la reacción colorimétrica y encontramos los resultados en unos pocos segundos. La observación revela que el límite de detección (LOD) de los adulterantes se encuentra en el rango entre \(0,05\%\) (vol./vol.) y \(0,2\%\) (vol./vol.) utilizando el método colorimétrico. técnica de detección. La cantidad desconocida de adulterantes añadidos se mide utilizando las curvas de calibración obtenidas de los resultados de los experimentos. En este documento se analizan exhaustivamente la repetibilidad y reproducibilidad del proceso, la sensibilidad y el rango lineal de detección de las curvas de calibración y el estudio estadístico de los datos de intensidad del color. En cualquier entorno con recursos limitados, se espera que este dispositivo de microfluidos 3D simple, portátil y fácil de usar se utilice para probar alimentos líquidos antes de su consumo.

La adulteración de alimentos es un problema grave a nivel mundial y ha recibido mucha atención por parte de las autoridades de seguridad alimentaria porque es peligroso para la salud de las personas. La leche es uno de los alimentos más adulterados en los países en desarrollo, que representan aproximadamente la mitad de la producción total de leche en todo el mundo, incluidos India, Pakistán, China y Brasil. La disponibilidad de leche per cápita aumenta año tras año, pero existe una brecha significativa entre la tasa de crecimiento actual y la tasa de crecimiento requerida de la producción de leche. El consumo de leche es alto porque es un alimento nutritivo de bajo costo enriquecido con proteínas, grasas, carbohidratos, vitaminas, minerales, etc. La adición de adulterantes hace que el negocio lácteo sea rentable al cerrar la brecha entre la oferta y la demanda. La contaminación parece ser uno de los medios accesibles para satisfacer las necesidades de los consumidores de leche produciendo más leche sintética1.

La leche está contaminada con urea2,3,4, melamina5,6, detergentes7, ácido bórico8, formalina9, sulfato de amonio, jabones, sal, neutralizadores10, maltodextrina11, almidón, azúcares12, clenbuterol13, tetraciclina14, peróxido de hidrógeno15, caramelo, agua16,17 y muchas otras sustancias nocivas18. Estos productos químicos son económicos y están ampliamente disponibles. La falta de leyes estrictas para hacer cumplir la ley y la falta de técnicas de detección rápidas y sencillas son los principales obstáculos para mantener este problema bajo control. La calidad de la leche, por lo general, está determinada por el porcentaje de grasa, el valor SNF (sólido sin grasa), el contenido de proteína y otros factores19. Para mejorar estos parámetros, habitualmente se añaden adulterantes a la leche1. Se agrega agua a la leche para aumentar el volumen. Por el contrario, la urea y la melamina aumentan el contenido de nitrógeno no proteico de la leche. Los detergentes y jabones aumentan la blancura de la leche y emulsionan el aceite añadido. Para la conservación de la leche se utilizan peróxido de hidrógeno, sal y formalina. El azúcar y el almidón se utilizan para aumentar la densidad de la leche diluida, mientras que el hidrogenocarbonato de sodio y el carbonato de sodio se utilizan para neutralizar la acidez de la leche. Las directrices de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y otras autoridades de seguridad alimentaria especifican el límite seguro de consumo de estos productos químicos20. El límite de seguridad de la urea en la leche es de 70 mg/100 ml21. Para el peróxido de hidrógeno y el almidón, el límite máximo de residuos (LMR) es \(0,05\%\) v/v y \(0,15\%\) v/v respectivamente22. Para detergentes y jabones, el límite de seguridad es inferior a 0,002 mg/kg23. Según la Autoridad de Normas y Seguridad Alimentaria de la India (FSSAI), la leche no debe contener ninguna cantidad añadida de sal ni carbonatos24. El consumo de estos contaminantes por encima del límite seguro puede provocar enfermedades nocivas como insuficiencia renal, muerte infantil, complicaciones gastrointestinales, diarrea, insuficiencia renal e incluso cáncer en humanos21.

Durante mucho tiempo se han utilizado diferentes técnicas de laboratorio, como la prueba de densidad del lactómetro, la prueba del punto de congelación, la prueba de proteínas de Kjeldahl25, la prueba de grasas de Gerber y otras26, para caracterizar diferentes propiedades de la leche. Sin embargo, estos procesos no pueden detectar la mayoría de los adulterantes químicos. Los investigadores han desarrollado diversas técnicas de detección de diversos adulterantes, como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la espectroscopia infrarroja, la espectrometría de masas, el análisis de señales electroquímicas, la fluorescencia, la admitancia y la detección colorimétrica con nanopartículas27,28,29,30,31. ,32,33, entre otros. Por otro lado, estas pruebas de laboratorio basadas en instrumentos son costosas y, en muchos casos, requieren mucho tiempo. Además, estos métodos tienen desventajas, incluido el peso, la disponibilidad, el consumo de energía y los requisitos de habilidades. Por lo tanto, la motivación de este trabajo es diseñar y fabricar un dispositivo accesible y de bajo costo34 que pueda usarse en una variedad de entornos, incluidos escenarios domésticos.

Las técnicas de microfluidos basadas en papel podrían ser la alternativa potencial para abordar las desventajas mencionadas anteriormente en el contexto de la detección de adulterantes en la leche35,36,37,38. Se informa que los enfoques de microfluidos basados ​​en papel se han utilizado para detectar metales pesados39,40, anticuerpos41, dióxido de azufre42, ácido benzoico43, D-glucosa44, formaldehído9 y otros compuestos en varias muestras de alimentos líquidos basándose en la detección colorimétrica. Whitesides et al.45 crearon un dispositivo en papel para detectar glucosa y proteínas en muestras de orina. Para darle una dirección adecuada al flujo, los autores cubrieron los papeles de cromatografía con agentes hidrófobos (SU-8 2010), seguido de la exposición a la luz ultravioleta para hacer que los canales sean hidrófilos. Sin embargo, la técnica de fotolitografía adoptada en su estudio es costosa y complicada. Por lo tanto, los investigadores han desarrollado métodos más simples para crear barreras hidrofóbicas46, como la impresión con cera47, la impresión con tinta de tóner usando una impresora láser48, el tratamiento con plasma de papel hidrofóbico49, la impresión 3D50, patrones de humectabilidad usando \(TiO_2\)51,52, usando lápiz hidrofóbico53, e incluso utilizando un lápiz corrector54. Se fabrica una tarjeta de prueba de papel para detectar urea, almidón, glucosa y otros adulterantes en la leche mediante un análisis de prueba puntual mediante la creación de puntos de detección hidrófilos12,55. Utilizando la técnica de impresión con cera56,57,58, recubrimiento PDMS59,60, etc., se fabrican barreras hidrófobas para almacenar los reactivos químicos en la zona circular hidrófila. Luego de unos minutos, las reacciones colorimétricas se capturan en los celulares y se utilizó análisis de imágenes para determinar la cantidad de adulterantes agregados39,43,44,61,62. Estos métodos tienen inconvenientes tales como baja resolución, alto costo, falta de disponibilidad de la impresora de cera, resistencia de la barrera hidrófoba, falta de detección simultánea, etc. Por otro lado, el método de impresión por chorro de tinta63 es simple, rápido y económico, pero la resistencia de la barrera es insuficiente para restringir el flujo de reactivos dentro de la zona de detección para diferentes muestras líquidas. Estos diversos métodos de fabricación de barreras hidrofóbicas demuestran la importancia de la investigación para desarrollar una técnica de fabricación sencilla. A pesar de varias ventajas mencionadas anteriormente, los dispositivos basados ​​en papel adolecen de varios problemas. La estructura porosa del papel a menudo disminuye el transporte de líquido al lugar deseado debido a que el líquido se propaga en todas direcciones. Otras desventajas relacionadas con los dispositivos de microfluidos basados ​​en papel son la pérdida de muestra debido a la evaporación, el paso de pretratamiento de la muestra, la baja sensibilidad, el alto LOD, la menor vida útil de los reactivos almacenados y, lo más importante, la falta de comercialización64.

Aquí, hemos creado un diseño novedoso para un dispositivo de microfluidos basado en papel, portátil y de bajo costo en 3D que puede detectar múltiples adulterantes simultáneamente en una muestra líquida utilizando un pequeño volumen de muestra líquida (1 a 2 ml). El flujo de líquido se produce en los sustratos de papel porosos debido a la acción capilar inherente. Como no se utilizan recubrimientos (super)hidrófobos, el dispositivo es duradero y puede usarse para la detección de adulterantes en muchos alimentos líquidos. El diseño patentado (App. no 345721-001) del dispositivo 3D garantiza que el caudal de líquido siga siendo el mismo que el del sustrato de papel puro. Se hacen algunos cortes en la capa de soporte intermedia para reducir la resistencia del flujo de líquido sobre el sustrato de papel, y la velocidad del flujo de líquido sigue siendo la misma que en el caso de papel puro. La técnica de detección colorimétrica identifica los adulterantes en las zonas de detección y se ha realizado un análisis cuantitativo mediante una prueba de intensidad de color. Por primera vez, demostramos que el dispositivo podía detectar urea, detergentes, jabón, almidón, peróxido de hidrógeno, hidrogenocarbonato de sodio y sal simultáneamente en muestras de leche. La técnica de detección simultánea de adulterantes patentada (App. no 202141024502) para muestras de leche es mejor que la detección convencional basada en una sola tira, donde se requieren múltiples experimentos para identificar un adulterante. La cantidad de adulterantes añadidos a la leche se cuantifica mediante la prueba de intensidad del color, con límites de detección que van desde \(0,05\%\) (vol/vol) hasta \(0,2\%\) (vol/vol) para diferentes adulterantes utilizando la dispositivo. Una técnica de fabricación rápida y sencilla hace que el dispositivo sea adecuado para su uso en entornos con recursos limitados. El diseño del dispositivo es escalable, lo que permite modificar fácilmente el número de puntos de detección. Además, utilizando el diseño actual del dispositivo, descubrimos el límite de detección cercano a las técnicas de detección basadas en instrumentos existentes. Por lo tanto, este dispositivo cumplirá con los criterios ASEGURADOS (Asequible, Sensible, Específico, Fácil de Usar, Rápido y Robusto, Sin Equipo, Entregado a quienes lo necesitan) al abordar tanto los aspectos técnicos (ASSR) como los de aceptación del usuario (UED). juntos.

Se detectan diferentes adulterantes mediante un sistema de microfluidos en papel mediante técnicas colorimétricas. La Tabla S1 muestra las variaciones de color de las zonas de detección en presencia de diferentes adulterantes. La Figura 1 muestra el cambio de color a medida que aumenta la concentración de adulterantes añadidos. La ilustración muestra que cuando aumenta la concentración de adulterantes, también aumenta la intensidad del color particular. La aparición de patrones de color no uniformes en la zona de detección se debe a la deposición de reactivos químicos después de la evaporación del disolvente. Controlar el flujo de evaporación y el flujo interno de Marangoni/flotabilidad para crear un patrón de color uniforme en la zona de detección está más allá del alcance de esta investigación. Sin embargo, la variación de la intensidad del color a lo largo del radio de los puntos circulares se muestra en la Fig. S1. Es fácilmente visible que no hay mucha variación para la concentración más baja, mientras que para la concentración más alta, la variación de color es mayor. Encontramos que la intensidad del color disminuye desde el centro hacia la dirección radial para algunos adulterantes. Sin embargo, la intensidad aumenta desde el centro hacia la dirección radial para el peróxido de hidrógeno y la urea. Se utilizan pruebas de intensidad de color para cuantificar la cantidad de adulterantes adicionales. Se producen pequeños puntos hidrofílicos circulares sobre papel para mantener los productos químicos en la plataforma de prueba puntual. Luego, la leche pura se mezcla con cantidades variables de adulterantes (\(\rho\)) y se vierte en el punto circular con una jeringa. Todos los puntos tienen 10 \(\upmu\)L de reactivos y 20 \(\upmu\)L de muestras. La urea, los detergentes, el almidón, la sal, \(H_2O_2\), \(NaHCO_3\) y los jabones se prueban a temperatura ambiente. Los puntos de detección cambiaron de color tan pronto como la muestra entró en contacto con los reactivos. No hay demora para cambiar el color en los puntos de detección en presencia de los adulterantes. Para comprobar la repetibilidad de la intensidad del color para la misma concentración, realizamos la prueba de Anova en los valores de intensidad. En la Tabla S2, mostramos un resumen de la prueba Anova unidireccional donde se acepta la hipótesis nula de considerar que todas las medias de los valores de intensidad del color son iguales.

El cambio de color después de la reacción colorimétrica para diferentes concentraciones de adulterantes se ha demostrado para todos los adulterantes.

Se muestran curvas de intensidad de color para ocho adulterantes diferentes con concentraciones variables de \(0,05\%\) a \(1\%\) (v/v) añadidos a la leche para (a) urea, (b) almidón, (c) sal, (d) detergente, (e) peróxido de hidrógeno, (f) jabón y (g) hidrogenocarbonato de sodio. De la figura se desprende claramente que al aumentar la concentración también aumenta la intensidad del color.

Las intensidades de color promedio (I) de las zonas de detección se determinan usando técnicas de procesamiento de imágenes. Utilizando la aplicación ImageJ se obtienen los valores de intensidad del rojo (R), verde (G) y azul (B)48. Los valores de intensidad de gris normalizados se calculan para todos los adulterantes excepto la sal utilizando la ecuación. (1) y para la sal usando la Ec. (2).

Las curvas de intensidad de color para todos los diferentes adulterantes con diferentes concentraciones (\(\rho\)) se muestran en la Fig. 2. En la mayoría de las situaciones (excepto en la sal, donde el cambio de color ocurre de intensidad baja (marrón) a alta (blanca) ), empleamos valores de intensidad inversos (\(I '=255-I\)) para representar el color específico en orden ascendente a medida que pasaba de un color de alta intensidad a uno de baja intensidad. Hicimos una investigación cuantitativa de una cantidad desconocida de adulterantes añadidos a la leche utilizando estas curvas de intensidad de color. La Tabla S3 contiene las curvas de calibración descubiertas mediante el ajuste de curvas \((R^2>0.95)\) de los gráficos de intensidad de color. Sin embargo, para realizar el análisis cuantitativo hemos utilizado las curvas de ajuste de regresión lineal clásica que se muestran en la Fig. 2. Con cinco experimentos repetidos en cada concentración diferente, se forman las curvas de intensidad del color y las barras de error se representan como la desviación estándar de la múltiples experimentos. Se describen más detalles sobre el análisis de la intensidad del color en la subsección de análisis de errores.

La linealidad en el rango de trabajo previsto debe validarse para cualquier curva de calibración. Para la mayoría de los casos de nuestro estudio, el rango lineal es el mismo que el rango dinámico, por lo que este proceso proporciona datos más exactos y precisos65. En la mayoría de los casos, las curvas son lineales ya que los valores de regresión son superiores a 0,9 en el rango de \(0,05\% (v/v)\) a \(1\% (v/v)\). La investigación detallada del estudio de rango lineal se muestra en la Fig. 2. Aquí, hemos mencionado el límite visible de detección (LOD) cualitativamente de la reacción colorimétrica. La intensidad de los cambios de color se identifica utilizando ImageJ, que se muestra en la Fig. 2. El cambio mínimo perceptible en la intensidad del color de cada caso se considera como el LOD del dispositivo66. Descubrimos que el LOD de estos adulterantes utilizando la metodología de detección colorimétrica es casi idéntico al de los métodos convencionales. La sensibilidad de las respuestas lineales y la comparación de los LOD de los procesos existentes con el trabajo actual se resumen en la Tabla 1. Sin embargo, existe la necesidad de mejorar aún más el LOD para utilizar el dispositivo para ensayos de campo, como máximo. El límite de residuos (MRL) es menor que el LOD del dispositivo de papel. Este dispositivo no es lo suficientemente sensible para detectar la bajísima cantidad de adulterantes en las muestras de leche. Para mejorar aún más la sensibilidad del dispositivo, se puede integrar con detección electroquímica y colorimétrica, que es el alcance futuro de este estudio.

También se prueba la intensidad del color para determinar su estabilidad en el tiempo. Las diferencias de intensidad de color para todas las zonas de detección se muestran en la Fig. 3 al inicio y al final de 30 minutos. En el intervalo de tiempo de 30 minutos, observamos que la diferencia máxima entre las intensidades de color al inicio y al final se encuentra en \(4.8\%\) para el adulterante peróxido de hidrógeno. De estos resultados se desprende claramente que los usuarios pueden tomar imágenes después de un tiempo para realizar la prueba y, por lo tanto, la ausencia de imágenes instantáneas no tiene ningún efecto en los resultados.

Aquí se muestran los valores de intensidad de color de las zonas de detección durante 1 min y 30 min.

La representación esquemática de (a) el dispositivo compacto. Se agrega muestra al dispositivo a través del orificio en la cubierta superior para realizar pruebas. (b) Vista detallada del dispositivo. Aquí se muestran tres capas: la cubierta superior \((L_1)\), el dispositivo de microfluidos basado en papel 3D y la cubierta inferior \((L_2)\). (c) Aquí se muestra el dispositivo de microfluidos basado en papel 3D de doble capa. Se trata de una estructura tipo sándwich en la que se intercala un soporte sólido entre dos capas de papel de filtro. \(L_3\) representa la zona de transporte, \(L_4\) representa la capa de plástico sólido y \(L_5\) representa la zona de detección. (d) Diseño en la parte posterior de la cubierta inferior. Se proporcionan el nombre de los adulterantes y una banda de color para su identificación cualitativa y cuantitativa. (e) Se muestra la imagen de la detección simultánea de los siete adulterantes utilizando el dispositivo de microfluidos basado en papel 3D (solo la capa intermedia).

Se realiza un diseño 3D y se fabrica el dispositivo para realizar simultáneamente la prueba de adulteración múltiple. El esquema del dispositivo 3D se muestra en la Fig. 4. La Figura 4a muestra el esquema del dispositivo compacto, mientras que las Fig. 4b, c representan la vista detallada del dispositivo y la capa intermedia de la estructura tipo sándwich, respectivamente. La Figura 4d muestra el diseño de la cubierta inferior. En la Fig. 4e, se muestra la imagen experimental donde se realiza la detección simultánea de siete adulterantes en la capa intermedia. Estudiar la especificidad de los reactivos y el efecto de la interferencia sobre la intensidad del color de diferentes adulterantes es fundamental para la detección simultánea de adulterantes en el dispositivo 3D. Agregamos un adulterante específico a cada zona de reacción para el análisis de especificidad. Además de las zonas de detección, hemos creado una zona de control donde no se almacenan reactivos. Descubrimos un cambio casi insignificante en la intensidad del color en la zona de control para muestras puras y adulteradas. Como resultado, asumimos que el valor de intensidad del color de las muestras de leche en la zona de control es 255 porque parece de color blanco puro. Se descubre que hay un cambio de color en una ubicación específica sólo para el adulterante específico. La Figura 5 muestra un estudio detallado de especificidad de todos los adulterantes. Todos los experimentos se llevan a cabo a una temperatura de \(25 \pm 2\) \(^\circ\)C. Preparamos las muestras adulteradas en agua destilada usando cada uno de los adulterantes por separado y luego las agregamos a todos los puntos de detección del dispositivo. Con base en estos resultados, podemos concluir que los reactivos son específicos de un solo adulterante o de un grupo de adulterantes, ya que no cambian de color en presencia de otras sustancias químicas. También utilizamos leche pura para ver si había algún cambio de color en los puntos de detección. Sin embargo, los reactivos no afectan el color de la leche pura. Estos reactivos no reaccionan con ningún ingrediente de la leche pura y reaccionan sólo cuando los adulterantes están presentes, seguido del cambio de color. Por tanto, la prueba de interferencia de color se lleva a cabo considerando sólo unos pocos adulterantes. A partir de la prueba de interferencia determinamos que hay pocos cambios en la intensidad del color durante la detección simultánea debido al efecto de interferencia de múltiples adulterantes. Para la prueba de interferencia se preparan dos muestras diferentes de leche del mismo volumen con la misma cantidad de adulterantes añadidos. En una muestra se mezclan todos los adulterantes, mientras que en otra solo se añade un adulterante. Luego se realiza la detección colorimétrica de la mezcla y el adulterante único para determinar el cambio en la intensidad del color. La Figura S2 revela la detección colorimétrica de adulterantes tanto para una mezcla de adulterantes como para un solo adulterante. La Figura 6 muestra la diferencia en los valores de intensidad del color del adulterante único y la mezcla de adulterantes. La interferencia de color se define como la diferencia en la intensidad del color entre la intensidad del analito único y la mezcla de adulterantes. La comparación de las intensidades de color muestra que el efecto de interferencia de los adulterantes sobre la intensidad de color es significativamente menor. Como resultado de su especificidad razonable y un cambio menor en la intensidad del color debido a la interferencia, la detección simultánea de adulterantes en la plataforma de microfluidos basada en papel es completamente posible.

Resultados experimentales de la prueba de especificidad. (a) Solo se muestran los reactivos en las diferentes zonas de detección donde el número representa las zonas de detección de urea (2), \(H_2O_2\) (3), jabón (4), sal (5), \(NaHCO_3\). (6), detergente (7), almidón (8) y control (1). Se ha demostrado la especificidad de los reactivos para (b) almidón, (c) urea, (d) \(NaHCO_3\), (e) \(H_2O_2\), (f) detergente, (g) jabón y (h) sal.

Aquí se muestra la diferencia en la intensidad del color de la mezcla de adulterante y del adulterante único. La interferencia máxima se encuentra en aproximadamente \(30\%\) para el peróxido de hidrógeno, pero en todos los demás casos es inferior a \(10\%\).

Los experimentos se llevan a cabo utilizando el \(\mu\)PAD 3D para la detección simultánea de múltiples adulterantes en un solo paso. La Figura 4e muestra la detección colorimétrica de múltiples adulterantes en un solo dispositivo. Para un volumen submicrométrico de muestra, la dispensación requiere una configuración dedicada, lo que puede aumentar el costo del dispositivo. Además, aumentará el costo operativo y puede resultar útil para usuarios expertos. Por otro lado, la detección colorimétrica requiere un volumen específico de reactivos. El cambio de color distintivo esperado no será apreciable en el caso de una muestra o volumen de reactivo bajo. Por lo tanto, después de varias pruebas, hemos utilizado 10 \(\upmu\)L de reactivos en todos los puntos de detección de este estudio. Para la detección simultánea de adulterantes en la muestra de leche se utiliza en diferentes experimentos un volumen promedio de 1,5 mL de leche. Sin embargo, se requieren estudios futuros para optimizar el volumen de muestra/reactivos, y debemos implementar las modificaciones de diseño correspondientes para medir y dispensar fácilmente la cantidad exacta de muestras. Se ha descubierto que el cambio de color suele producirse tan pronto como la muestra entra en la zona de detección. Utilizando las curvas de calibración mencionadas anteriormente que se muestran en la Fig. 2, determinamos la cantidad agregada de adulterantes en muestras de leche para análisis cuantitativo. Antes de dispensar la leche en el dispositivo, se añaden diferentes cantidades de adulterantes a la muestra de leche. Después de la reacción colorimétrica, se toman imágenes con una cámara. Las intensidades de color se extraen de estas imágenes y se ingresan en ecuaciones de calibración para calcular la cantidad agregada. En las curvas de calibración mencionadas en la Fig. 2, X representa los porcentajes (v/v) de adulterantes detectados en la leche, e Y representa los valores de intensidad de color de los puntos de detección después de las reacciones colorimétricas. La Tabla 2 muestra una comparación de la cantidad real de adulterantes agregados, los resultados de las curvas de calibración y la precisión del dispositivo. Hemos obtenido la tasa de recuperación (RT) del dispositivo de papel usando la relación 14,40,71,72, \(RT = \frac{\text {Cantidad recuperada}}{\text {Cantidad agregada}}\times 100\% \). Al utilizar el dispositivo, se encuentra que los porcentajes de recuperación de los adulterantes agregados están en el rango de 85 a 107 % con una buena reproducibilidad de 0,50 a 3,51 % (RSD = desviación estándar relativa) después de múltiples experimentos. Utilizando el método de detección de intensidad del color, logramos una precisión de detección de más del \(80\%\). El documento complementario muestra la imagen real de un dispositivo compacto usado en la Fig. S3. También agregamos un video de detección simultánea de adulterantes en muestras de leche utilizando el dispositivo de microfluidos 3D basado en papel en el video complementario S1.

Finalmente, se lleva a cabo una estimación de costos para la fabricación del dispositivo de microfluidos 3D basado en papel. Se conocen los precios de los productos químicos, papeles y solventes por una cantidad específica. Por lo tanto, dividimos el costo total de la cantidad específica para determinar el costo de la cantidad utilizada. El precio de una caja de 100 papeles de filtro Whatman (grado 4) es de Rs. 1300 (\(16.39\$\)), y usamos un papel para hacer un dispositivo. Como resultado, costará Rs. 13 (\(0,16\$\)). De manera similar, se usa una cierta cantidad de reactivos para preparar una solución de 10 ml con diferentes solventes, y solo se usan 10 \(\upmu\)L de esa solución para fabricar el dispositivo. El precio para crear un dispositivo figura en la Tabla S4. El precio del disolvente está incluido en el precio del reactivo. Según el análisis de costos, el precio aproximado de un dispositivo es de Rs. 17,70 (\(0,23\$\)). Una comparación detallada del costo, LOD y tiempo de prueba con los métodos tradicionales se describe en el documento complementario de la Sección. S8.

En el presente trabajo, se fabrica y utiliza un dispositivo a base de papel (papel de filtro Whatman grado 4) para detectar múltiples (siete) adulterantes en muestras de leche simultáneamente según la técnica colorimétrica. La observación revela que sólo se requieren de 1 a 2 ml de volumen de muestra para cada prueba y el tiempo de prueba es inferior a 30 s. Se llevan a cabo análisis cualitativos y cuantitativos, con un rango de recuperación de 85 a 107 % y un rango de RSD de 0,50 a 3,51 % utilizando las curvas de calibración desarrolladas. El rango lineal, la sensibilidad y el LOD de los adulterantes se acercan a los métodos existentes. El costo de la prueba para siete adulterantes es de aproximadamente \(0,23\$\). El método es fiable para detectar adulterantes en la leche en el momento. Además, el método liviano, económico, fácil de usar y respetuoso con el medio ambiente hace que este dispositivo sea adecuado para inspeccionar muchos alimentos líquidos. De la investigación se deduce que en este método el reactivo sólo reacciona con el adulterante específico y no con ningún ingrediente de la leche. Por lo tanto, esta herramienta analítica puede ayudar a monitorear la seguridad de los alimentos líquidos y así aumentar la trazabilidad de la leche contaminada en áreas remotas de los países en desarrollo.

Cabe señalar que modificando adecuadamente los reactivos químicos, el dispositivo actual se puede utilizar no sólo para leche sino también para agua, batidos de proteínas, zumos de frutas, etc. Además, el objetivo futuro es utilizar una aplicación móvil para realizar análisis cuantitativos. para determinar la concentración de adulterantes. También se hará hincapié en abordar las posibles limitaciones del dispositivo desarrollado, por ejemplo, el efecto de evaporación de reactivos, una plataforma común para encontrar la intensidad del color en diferentes brillos, detectar cualquier adulterante desconocido utilizando inteligencia artificial, etc.

Sigma Aldrich proporciona productos químicos como para-dimetilaminobenzaldehído (p-DMAB), fenolftaleína, púrpura de bromocresol, solución de yodo, dicromato de potasio, nitrato de plata, yoduro de potasio, ácido rosólico, ácido clorhídrico y etanol, así como diferentes adulterantes como urea, agua oxigenada, hidrogenocarbonato de sodio y papel de filtro Whatman grados 1 y 4 (forma rectangular y circular). En las tiendas locales se obtienen jabón, detergentes, almidón en polvo, sales, diferentes muestras de leche (muestras de leche tonificada disponibles comercialmente que contienen \(3\%\) de grasa), papel fotográfico, láminas de PVC y otros artículos. Todos los productos químicos se utilizan sin ninguna purificación adicional.

Todos los reactivos se disuelven en agua destilada o en etanol, dependiendo de su solubilidad. Mediante técnicas de detección colorimétrica, todos los adulterantes se detectan en diferentes muestras líquidas. Para detectar urea, se prepara una solución de p-DMAB \(1,6\%\) (p/v) disolviéndola en una solución \(10\%\) (v/v) de ácido clorhídrico concentrado en etanol. Para detectar jabón y detergentes, se utilizan una solución reactiva de fenolftaleína \(1\%\) (p/v) disuelta en etanol y una solución de \(0,5\%\) (p/v) púrpura de bromocresol disuelta en agua, respectivamente. \(1\%\) (p/v) yodo añadido a una solución \(10\%\) (p/v) de yoduro de potasio disuelto en agua se utiliza para detectar almidón. Para detectar la sal, hemos utilizado la precipitación producida al mezclar una gota de solución de dicromato de potasio 0,1 N y solución de nitrato de plata 1 N disueltas en agua. Se utiliza una solución saturada de yoduro de potasio disuelta en una solución de agua y etanol (3: 1 v/v) para detectar \(H_2O_2\). Los neutralizadores como el hidrogenocarbonato de sodio se detectaron utilizando una solución de ácido rosólico \(1\%\) (p/v) disuelta en etanol. Hemos añadido una gota de leche contaminada a las zonas de detección después de adulterarla con diferentes químicos para comprobar las reacciones colorimétricas. La urea interactúa con p-DMAB en un medio ácido para producir una sustancia química amarilla (Fig. 7a). La Figura 7 muestra una ilustración esquemática de reacciones químicas. Realizamos esta prueba con varias concentraciones de urea para ver si hay diferencias en la intensidad del color, y descubrimos que un aumento en la concentración de urea da como resultado un aumento en la intensidad del color amarillo. También se introducen diferentes adulterantes en la leche y se realiza una detección colorimétrica. La solución de yodo se combina con almidón para producir un compuesto azul (Fig. 7b). En presencia de detergente, el indicador bromocresol da un tono índigo en un medio menos ácido (Fig. 7d), y la sal reacciona con la precipitación de dicromato de plata para dar una precipitación de cloruro de plata blanca (Fig. 7c). Se forma un compuesto de yodo de tono marrón cuando el peróxido de hidrógeno se combina con una solución saturada de yoduro de potasio (Fig. 7e). En presencia de jabón, la fenolftaleína adquiere un color rosado en el medio menos ácido, y el hidrogenocarbonato de sodio se combina con la solución alcohólica de ácido rosólico para generar una molécula de color rojo rosado (Fig. 7g). Todas las mediciones se realizan utilizando una balanza (Pioneer, Ohaus) con una precisión de 1 mg, un recipiente medidor y una pipeta. Para analizar muestras de alimentos líquidos, utilizamos agua destilada y leche tonificada. Para el análisis de prueba puntual, se agregan diferentes concentraciones de un adulterante a 10 ml de muestras líquidas. Para la detección simultánea de múltiples adulterantes, agregamos diferentes adulterantes a una muestra de leche de 10 ml. Debido a la adición de más compuestos sólidos en la leche, su densidad aumenta y por lo tanto se encuentra un valor mucho más alto en la lectura del lactómetro en comparación con la leche pura. Por lo tanto, agregamos agua destilada a la muestra para diluirla de modo que la lectura del lactómetro siga siendo comparable a la de la leche pura. Los detalles de la preparación de la muestra se describen en el documento complementario en la Fig. S4.

Representación esquemática de las reacciones colorimétricas de (a) urea73, (b) almidón74, (c) sal75, (d) detergente76, (e) \(H_2O_2\)77, (f) jabón78 y (g) \(NaHCO_3\). )79.

Utilizamos análisis de prueba puntual para realizar la prueba de intensidad del color y determinar el límite de detección (LOD) de las mediciones. Los pequeños patrones circulares de 16 mm de diámetro se crean utilizando el software de dibujo AutoCAD 2021 y se imprimen en una impresora láser comercial HP (Laser Jet Pro MFP M227fdn). El diámetro de la zona circular se calcula equiparando el volumen disperso del líquido (40 \(\upmu\)L) con la altura y el área de la zona circular. Para que el papel impreso sea hidrofóbico, se deben bloquear los poros de ambas caras del papel. Entonces, el papel se calienta en una placa caliente (Spinot) durante 20 minutos a \(170 \pm 1\) \(^\circ\)C para bloquear los poros del otro lado48. La tinta se derritió y se extendió a través de los poros hacia el otro lado del papel como resultado del calentamiento. Para estabilizar el recubrimiento, la hoja de papel se deja a temperatura ambiente durante 5 min. Medimos el ángulo de contacto de la barrera hidrofóbica con un goniómetro (Holmarc), que es \(120\pm 2^\circ\).

Hemos utilizado un sistema láser universal \(CO_2\) (10.6 \(\upmu\)m \(CO_2\) Laser, 60 W de potencia) (usado \(3\%\) de velocidad máxima, \(3\% \) de potencia máxima para papel, y \(11\%\) de potencia máxima y \(2\%\) de velocidad máxima para plástico) para cortar los papeles en las formas deseadas. El dispositivo de microfluidos 3D basado en papel se compone de una cubierta superior e inferior (\(100 \times 100\) mm\(^2\)) y una capa intermedia de estructura tipo sándwich. Se proporciona un pequeño orificio de 10 mm de diámetro en la cubierta superior para agregar la muestra. La cubierta inferior tiene múltiples orificios (de 16 mm de diámetro) para inspeccionar los hallazgos después de las pruebas. El dispositivo de papel con estructura tipo sándwich tiene una capa de plástico intercalada entre las dos capas de papel para mejorar la resistencia del dispositivo. En la capa superior de papel, hay un punto de entrada de muestra (10 mm de diámetro), pistas primarias (\(10 \times 6\) mm\(^2\)), pistas anulares (5 mm de ancho), pistas secundarias (\(5 \times 4\) mm\(^2\)), y una zona de transporte vertical (16 mm de diámetro). La capa de plástico soporta el papel y tiene varios cortes (\(10 \times 2\) mm\(^2\)) y agujeros (12 mm de diámetro) para mejorar la velocidad y transmitir la muestra a la segunda capa del papel (Fig. .S5). La zona de detección (16 mm de diámetro) en la capa inferior de papel es donde se cargarán los agentes detectores. Se utilizan cinta de doble cara y pegamento para unir las zonas de transporte y detección a la capa de plástico, respectivamente. Este diseño 3D funciona bien para transportar líquidos más densos a una velocidad constante. El número de pruebas se puede aumentar modificando el tamaño de la pista del anillo. Durante las pruebas, las sustancias se vierten en la pequeña abertura de la cubierta superior (1 a 2 ml) y se trasladan a la zona de detección a través de pistas de papel debido a la acción capilar. Se proporciona una cubierta transparente en el exterior del dispositivo para reducir la tasa de evaporación del reactivo. El papel se trata con reactivos y se deja secar. Ambas capas de papel se adhieren a ambos lados del soporte después del secado, y las cubiertas se adhieren con cinta adhesiva de doble cara. Por un lado guardamos los reactivos y por el otro guardamos las muestras. La muestra entra en contacto con otra capa a través de los orificios de soporte debido a la movilidad vertical del líquido. Las imágenes de las zonas de detección son tomadas por una cámara DSLR (Nikon D750) con una lente de distancia focal de 105 mm, manteniendo una apertura de lente constante de f/4.5, ISO 1000 y una resolución de \(2624 \veces 3936\) píxeles cada vez. Debido a su alta porosidad (tamaño de poro promedio de 25 \(\upmu\)m) y espesor (210 \(\upmu\)m), en este diseño se utiliza papel de filtro Whatman grado 4, que ayuda al flujo de líquido y permite para el almacenamiento de más reactivos. Comparamos las cualidades del papel de grado 4 con las del papel de filtro de grado 1 (utilizado principalmente en investigación, tamaño de poro de 11 \(\upmu\)m, espesor de 180 \(\upmu\)m) realizando múltiples experimentos de flujo de líquido a través de ambos. tipos de papel. Los resultados demuestran que el flujo es más rápido en el papel de filtro Whatman de grado 4 que en el de grado 1 (Fig. S6).

Utilizando este diseño, hemos superado ciertas desventajas de los estudios anteriores. La detección simultánea de múltiples adulterantes se realiza utilizando el dispositivo 3D propuesto. No hemos utilizado ningún material hidrofóbico para crear el camino hidrofílico y los diferentes puntos circulares en el diseño actual del dispositivo. Por lo tanto, no hay problema de fuga de reactivos del dispositivo debido a la débil resistencia de la barrera hidrófoba. Nuestro método propuesto es fácil y escalable al eliminar el paso de recubrimiento hidrofóbico. Utilizando dos capas de papel para transporte y detección, hemos solucionado la contaminación cruzada de los reactivos. Otra ventaja de hacer una estructura 3D de dos capas de papel es que el flujo de líquido no se interrumpe debido al bloqueo de los poros del papel. Si se utiliza una capa de papel para realizar los experimentos, se producirá un reflujo de los reactivos a través de los canales del papel y eventualmente se bloquearán los poros. Por lo tanto, hicimos un diseño 3D donde el flujo de muestras líquidas y el almacenamiento de reactivos se realizaron en dos capas separadas, y la muestra llegó a las zonas de detección desde la parte superior.

En el diseño 3D (Fig. 4c), la capa superior de papel está unida a un soporte de plástico en la parte inferior cuyo espesor es similar al espesor del papel. Por lo tanto, el flujo de líquido debe interrumpirse debido a la fuerza de resistencia en la parte inferior del papel. Hemos comparado el flujo de líquido de tres casos diferentes y hemos considerado el caso óptimo para la fuerza y ​​la velocidad. Se toman tiras de papel (\(30 \times 6\) mm\(^2\)) y se realizan múltiples experimentos utilizando una configuración de sujeción de papel. Como el líquido fluye a través de toda la sección horizontal de papel en 30 s, en el caso de papel únicamente, se aplica el modelo analítico convencional de Lucas-Washburn (sin gravedad)16,80. En este modelo, el equilibrio de fuerzas se considera entre la fuerza capilar y la fuerza de resistencia viscosa, donde la altura del capilar (L) está relacionada con el tiempo (t) como, \(L \propto t^{0.5}\). A este único caso de papel lo denominamos Tipo 1 y descubrimos que satisface la relación convencional.

El tipo 1 es mejor que los otros casos posibles, ya que no hay ninguna fuerza de resistencia que actúe en la parte posterior del papel. A continuación, analizamos dos casos más en los que el papel con soporte de plástico en la parte posterior se denomina Tipo 2 y el papel con soporte de plástico con un canal cortado en la parte posterior se denomina Tipo 3. La representación esquemática de los tres casos se ilustra en la Fig. 8a. En cada uno de los tres ejemplos, se llevan a cabo muchas pruebas de flujo de líquido. Los resultados de los experimentos se comparan en la Fig. 8b. Descubrimos que la velocidad del flujo es aproximadamente idéntica en el Tipo 1 y el Tipo 3, pero es ligeramente menor en el Tipo 2 debido a la alta resistencia. Como resultado, elegimos el Tipo 3 como el mejor escenario porque proporciona resistencia debido a la capa de plástico y tiene una velocidad de flujo similar al Tipo 1 debido a la menor fuerza de resistencia causada por los cortes.

Aquí se muestra la representación esquemática de la capa de soporte, (a) para los tres casos, Tipo 1, Tipo 2, Tipo 3. (b) Comparación de los experimentos de distancia recorrida por el líquido en los tres casos diferentes.

El esquema gráfico del análisis estadístico se muestra aquí. (a) Aquí se muestra el rango \(\pm \sigma\) bajo la curva de distribución gaussiana. (b) Aquí se muestra el gráfico Q – Q de un conjunto particular de experimentos para verificar la tendencia de distribución normal de los valores de intensidad del color.

Se realiza un análisis de error detallado y se enumera en la Tabla 3. Aquí mostramos la instrumentación y el error sistemático para medir el volumen, el peso, la longitud y la intensidad del color. El volumen se mide mediante un frasco medidor y una pipeta, que tienen incertidumbre en la instrumentación. El peso se mide mediante una balanza que también tiene incertidumbre en la instrumentación. Consideramos la incertidumbre de la instrumentación al medir la longitud utilizando un cortador láser. Para experimentos repetidos, se considera la incertidumbre sistemática para medir la intensidad del color. Seleccionamos el punto con la barra de error máxima de todos los puntos de datos y encontramos el porcentaje de incertidumbre para el mismo.

Además, se analizan estadísticamente las intensidades de color de las zonas de detección para todos los adulterantes. Todos los datos de intensidad del color muestran la tendencia de distribución normal. Para obtener el valor promedio de las intensidades de color de los experimentos repetidos, hemos considerado los datos bajo el área \(67\%\) de la curva de distribución gaussiana. La representación esquemática de la curva gaussiana se muestra en la Fig. 9a. También realizamos el análisis gráfico cuantil-cuantil (Q – Q) para comprobar la tendencia gaussiana. En la Fig. 9b se muestra una representación del gráfico Q – Q para hidrogenocarbonato de sodio, donde la cola no coincide con la línea recta. Descubrimos que la distribución gaussiana de la intensidad del color está sesgada hacia la derecha y hacia la izquierda, pero el cuerpo principal coincide con la distribución gaussiana. En la Fig. S7 se muestra el gráfico de datos dispersos de algunos adulterantes para todas las diferentes concentraciones. También hemos realizado el análisis de regresión bayesiana con todos los puntos de datos. En los documentos complementarios S1 se describe una descripción detallada del análisis de regresión bayesiana para algunos adulterantes. La tabla de regresión bayesiana para los adulterantes se muestra en la Tabla S6.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado [y sus archivos de información complementaria]. Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual también están disponibles a través de solicitud razonable del autor correspondiente.

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Esta investigación cuenta con el apoyo del Instituto Indio de Tecnología de Madrás para el Grupo Micro Nano Bio Fluidics bajo el financiamiento para el esquema de Instituciones de Eminencia del Ministerio de Educación, Gobierno de la India [Sanción. No: \(9/11/2019-U.3(A)\)]. SP agradece la ayuda de Siddhant Mohapatra durante el análisis de los datos. PSM agradece las fructíferas conversaciones con la Dra. Puja Dudeja y la Dra. Subarna Sinha Mahapatra para comprender la gravedad del problema de la adulteración de la leche en la India.

Grupo Micro Nano Bio-Fluids, Departamento de Ingeniería Mecánica, Instituto Indio de Tecnología Madras, Chennai, 600036, India

Subhashis Patari, Priyankan Datta y Pallab Sinha Mahapatra

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SP diseñó los experimentos, caracterizó las actuaciones y analizó los datos. PSM supervisó este estudio. Todos los autores escribieron y revisaron el manuscrito y discutieron los resultados.

Correspondencia a Pallab Sinha Mahapatra.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Información complementaria 2.

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Reimpresiones y permisos

Patari, S., Datta, P. & Mahapatra, PS Dispositivo 3D de detección de adulteración de leche a base de papel. Informe científico 12, 13657 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17851-3

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Recibido: 28 de abril de 2022

Aceptado: 02 de agosto de 2022

Publicado: 11 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17851-3

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